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Servicebio ECL 組合包 (普通/靈敏/超靈敏)
商品編號：G2161-200ML
本產品是由普通ECL發光液、靈敏ECL發光液、超靈敏ECL發光液三種不同靈敏度的ECL發光液組成。ECL發光液基本原理是以luminol為基礎的化學發光；可與二抗上偶聯的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）發生反應而發光，通過X-光膠片曝光或其他成像方法（如熒光或化學發光成像儀）進行檢測；檢測極限分別為納克級、皮克級、飛克級，可滿足不同目的蛋白的曝光實驗需求。靈敏以及超敏ECL發光液在樣本濃度較低時依然能夠檢測信號，節省樣本；同樣低濃度抗體（一抗、二抗）孵育之後依然能夠檢測到信號，節省珍貴的抗體；靈敏ECL發光液相較於普通ECL發光液，信號值至少增強10倍；超敏ECL發光液相較於靈敏ECL發光液，信號值至少增強10倍。
實驗步驟
1. 將相同靈敏度的ECL A液和ECL B液等體積混合制成相應靈敏度的ECL工作液，室溫配制，現配現用；
2. Western Blot實驗中PVDF膜（或NC膜）經二抗孵育後，多次洗滌，濾紙吸去多余液體；將膜放在兩片潔凈保鮮膜（或PE手套）中間，加入ECL工作液覆蓋膜表面，此過程應小心完成，避免保鮮膜與PVDF膜（或NC膜）之間產生氣泡；
3. 充分反應之後，用濾紙或吸水紙吸去多余的ECL工作液，隨後進行壓片檢測或是熒光成像儀檢測；
4. 壓完的膠片用顯影、定影試劑（推薦G2019、G2023、G2024）進行顯影和定影（若為熒光成像儀曝光忽略此步驟）；根據發光強度調整曝光條件。
注意事項
1. ECL A液和B液吸液過程中務必更換槍頭，避免A液、B液交叉汙染，致使活性成分失效。
2. 在與膜發生接觸過程中，請佩戴手套且使用幹凈鑷子等潔凈器材，避免外源蛋白質及金屬離子汙染。
3. Sodium azide會抑制HRP的活性，所有相關試劑應避免使用。
4. ECL工作液配置完成後請於一天內使用完，請勿留置到第二天，以免影響實驗結果的準確性。
5. 各溶液使用後，請蓋緊瓶蓋避光保存，以防失效；特別是B液，含有氧化劑，容易被還原而失效。
6. ECL化學發光試劑盒選擇參照附表一，一抗及二抗推薦稀釋比測試數據均來自自研抗體。
7. ECL化學發光檢測常見問題及解決方案參照附表二。
8. ECL化學發光試劑盒A/B液均對人體有害，操作時務必小心，註意有效防護，避免直接接觸人體或吸入呼吸道。
9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
附表一：ECL選擇參考表
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產品名稱 |
普通ECL |
靈敏ECL |
超靈敏ECL |
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貨號 |
G2014 |
G2074 |
G2020 |
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檢測極限 |
Nanogram |
Picogram |
Femtogram |
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一抗稀釋比例 （1 mg/mL储存液） |
1:1000-1:5000 |
1:4000-1:10000 |
1:10000-30000 |
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二抗稀釋比例 （1 mg/mL储存液） |
1:1000-1:6000 |
1:3000-1:60000 |
1:6000-150000 |
附表二：ECL常見問題及解決方法
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常見問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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背景直很深/雜訊多 |
一抗與二抗的緩衝液或濃度不正確 |
降低一抗,二抗濃度 |
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Blocking不完全或濃度不對 |
磷酸化蛋白檢測務必使用BSA或無蛋白封閉液封閉；膜孔徑越小，封閉及洗脫時間應越長 | |
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一抗培養時間過短 |
適當延長培養時間 | |
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信号弱 |
一抗、二抗使用濃度偏低 | 提高一抗、二抗使用濃度 |
| 蛋白濃度低 | 增加上樣體積 | |
| 換用靈敏度更高的ECL化學發光試劑盒 | ||
| 熒光訊號很短，出現空心條帶 | 目的條帶熒光過強，快速消耗發光基底，substract消耗完之後就會出現反白的情況 | 降低蛋白上樣量或一抗、二抗的用量 |
| 膜上出現棕色或黃色條帶 | 目標區域HRP酶含量過於豐富，產生大量自由基，致使HRP酶氧化失活 | 降低蛋白上樣量或一抗、二抗的用量 |
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