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Servicebio SweMagrose His-Tag 蛋白纯化磁珠 (IDA-Ni)
商品編號：G3654-1ML
本產品是瓊脂糖磁珠通過IDA修飾後螯合鎳離子制備而成，可以對生物樣本中的含組氨酸標簽蛋白進行高效快速純化，無需離心過濾操作。操作過程簡單，適用於純化細菌、酵母、細胞表達上清或內表達的可溶性組氨酸標簽蛋白，也可結合高通量蛋白純化設備進行蛋白篩選分離等操作。
Ni2+具有6個配位數，具有較強的蛋白結合能力，CO2+具有4個配位數，非特異性吸附更少，若對純度有更高要求可選擇本公司另外一款SweMagrose His-Tag標簽蛋白純化磁珠（IDA-Co），貨號G3655。
操作步驟
1. 各種試劑配置參考如下,用戶可根據試劑情況選用合適的磁珠用量及緩沖液配方：
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Component |
Volume |
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10×PBS（200 mM Sodium Phosphate, pH7.4） |
50 mL |
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10xImidazole buffer（200 mM Sodium Phosphate，5 M Imidazole, pH7.4） |
50 mL |
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Nickel remover（10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl，100 mM EDTA, pH7.4） |
10 mL |
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Alkalinewashing solution（0.5 M NaOH, 2M NaCl） |
10 mL |
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Nickel chloride（100 mM NiCl2） |
15 mL |
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Preservation solution (20% ethanol) |
50 mL |
2. 緩沖液配置：
目標蛋白與金屬離子螯合磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率，各種緩沖液也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此，在較大規模蛋白純化之前，用戶應自行設計實驗，篩選出適合目標蛋白的緩沖液，包括結合緩沖液(Binding Buffer)，洗滌緩沖液(Wash Buffer )和洗脫緩沖液(Elution Buffer)；以下提供的緩沖液體系適用於多數組氨酸標簽蛋白的純化，供用戶參考：
Binding Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，5~50 mM Imidazole，pH7.4
Wash Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，50~100 mM Imidazole，pH7.4
Elution Buffer：20 mM Sodium Phosphate，500 mM NaCl，500 mM Imidazole，pH7.4
3. 樣品處理：
a) 大腸桿菌、酵母等細胞內表達蛋白：按每克細胞加入5~10 mL Binding Buffer，加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM的PMSF)，重懸細胞，冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過於粘稠，可根據需要在粗樣品中加入適量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，用戶也可以根據實際需要對蛋白樣品進行離心操作；
b) 胞外表達蛋白：取胞外表達上清，用等量Binding Buffer稀釋，即為粗蛋白樣品；
c) 動物細胞胞內表達蛋白：取適量動物細胞，用適量PBS(自備)洗滌1次，棄上清，用適量含1% (v/v) Triton X-100或1% (v/v) NP-40的Binding Buffer重懸，加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1mM的PMSF)，置於冰上10 min，即為粗蛋白樣品；
4. 目標蛋白與磁珠結合：
a) ⽤10 mL Binding Buffer懸浮2 g濕重的菌體，進行破碎和裂解之後，即為目標粗蛋白樣品，加入到裝有預處理磁珠的離心管中，將離心管置於漩渦混勻器振蕩15 s；
b) 將離心管置於旋轉混合儀上，室溫旋轉混合20～30 min（如果需要，可以在2～8℃的低溫環境下，旋轉混合1 h，防止目標蛋白降解)；
c) 將離心管置於磁性分離器上進行磁性分離，移出上清液至新的離心管中以備後續檢測，從磁性分離器上取下離心管進行後續洗滌步驟；
5. 磁珠洗滌：
a) 加⼊10 mL Wash Buffer到裝有磁珠的離心管中，輕輕翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測。重覆此述步驟1次；
b) 加入10 mL Wash Buffer到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移到新的離心管(避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白汙染目標蛋白)，磁性分離，移出上清液到清洗液收集管；
6. 目標蛋白洗脫:
a) ⽤戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋⽩濃度，加⼊2～10 mL Elution Buffer，輕輕翻轉離⼼管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標蛋白樣品；
a) 如果需要，可以重覆上述步驟1次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標蛋白是否洗脫完全；
b) 通過SDS-PAGE或Western blotting檢測目標蛋白。如果需要測定蛋白質濃度，可以采用Elution Buffer調零再進行測定，或者采用透析、超濾等方法去除Imidazole後再進行濃度測定；
7. 磁珠後處理：
a) 在裝有磁珠的離心管中加⼊5 mL Elution Buffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液；
b) 重覆上述步驟2次；
c) 在離心管中加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液；
d) 重覆上述步驟2次；
e) 加入保存液到磁珠中使總體積為5 mL，保存於2～30℃ (長期保存，置於2～8℃)，可用於下一次同種蛋白的純化；
8. 磁珠再生：
磁珠連續使用3次或以上，其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低，建議進行磁珠再生處理。以5 mL 10% (v/v)磁珠懸液為例，詳細說明磁珠再生操作：
a) 將磁珠懸液進行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液；
b) 加入5 mL去鎳劑，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合5 min，磁性分離，去除上清液。重覆此步驟1次；
c) 加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重覆此步驟2次；
d) 鹼處理(可選步驟)：加入5 mL鹼性清洗液，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合5 min，磁性分離，去除上清液。加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重覆ddH2O 洗滌步驟3～5次，至洗滌液呈中性為止；
e) 加入5 mL氯化鎳，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合20 min，磁性分離，去除上清液；
f) 加入5 mL ddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重覆此步驟4次；
g) 加入保存液到磁珠中使總體積為5 mL，保存於2～30℃(長期保存，置於2～8℃)。
注意事項
1. 本產品保存在20%乙醇中，使用前需替換。
2. 請勿冷凍、乾燥磁珠，可能會影響最終使用效果。
3. 使用時需選擇配套的磁力架使用。
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