本公司生產的pSWE-Topo Zero Cloning Kit，是一種通過自殺基因的表達與否進行陽性重組子篩選的載體，由pUC19載體改造而成。當目的基因片段沒有連接到載體中時，自殺基因成功正確表達，包含載體的細胞無法生長；當目的基因片段成功連接到載體中時，自殺基因將無法正確表達，包含載體的細胞可以正常生長，這種載體也被稱為“Zero”背景載體。同時本公司的pSWE-Topo Zero Cloning Kit使用一種新的載體連接方式，不需要額外加入連接酶進行片段與載體的連接反應，只需要將目的基因片段加入到載體中，室溫（22℃-37℃）反應5 min即可進行轉化操作。pSWE-Topo Zero Cloning Kit能夠兼容TA clone 與Blunt-End。
特點：使用方便，兼容TA clone 與Blunt-End；不需要進行額外的處理反應，體系中加入目的基因片段，室溫5 min即可進行正常轉化操作；成功率可達95%；短、長片段都適用；抗生素標記為Ampicillin；測序引物：M13 Forward Primer（5‘TGTAAAACGACGGCCAGT’3），M13 Reverse Primer（5‘CAGGAAACAGCTATGACC’3）。
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Component Number |
Component |
G3022-25T |
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G3022-1 |
pSWE-Topo Zero Vector (50 ng/μL) |
25 μL |
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G3022-2 |
Control Template (700 bp, 50 ng/μL) |
10 μL |
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G3022-3 |
M13 Forward Primer (10 μM) |
50 μL |
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G3022-4 |
M13 Reverse Primer (10 μM) |
50 μL |
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Manual |
One copy |
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實驗步驟
1. PCR產物的準備
（1）PCR產物不能磷酸化；（2）PCR反應使用高保真及Taq DNA Polymerase均可；（3）PCR產物推薦電泳後使用Gel extraction kit 進行純化。
2. 參考反應體系：
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Component |
Volume |
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pSWE-Topo Zero Vector (50 ng/ μL) |
1 μL |
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The target gene fragmenta |
0.5-4 μL |
插入片段推薦用量：載體與片段摩爾比=1:10-1:3。可以粗略地按照1 kb片段加入50 ng的量計算。如果構建基因文庫可適當擴大反應體系。
3. 按上述參考反應體系輕輕混合載體與基因片段，室溫（20-37℃）反應5-10 min，將離心管置於冰上。
4. 轉化：a，在反應體系中加入50-100 μL克隆感受態（或將反應產物加入50-100 μL克隆感受態中），輕輕混勻，冰浴30 min；b，將轉化體系立即於42℃熱激45 s，立即置於冰上2-3 min；c，在轉化體系中加入200 μL平衡至室溫的SOC或LB培養基，200 rpm、37℃孵育1 h；d，取200 μL菌液塗布抗性平板，37℃倒置培養過夜（為得到較多克隆，可以離心後去掉部分上清，將菌液全部塗布抗性平板）。
5. 陽性轉化子檢測：
a. 菌落PCR鑒定陽性克隆：挑取單克隆至10 μL無菌水中，渦旋混合，然後取1 μL混合液作為PCR模板，M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer作為通用引物，進行菌落PCR鑒定陽性克隆。（推薦G3304、G3305；PCR反應體系及程序參考相應產品說明書，陽性克隆PCR擴增片段＞100 bp）
b. 酶切鑒定陽性克隆：挑取單克隆接種於適量抗性液體培養基中，220rpm、37℃過夜培養。小量提取質粒，用適宜的限制性內切酶進行酶切，凝膠電泳鑒定陽性克隆。
c. 測序鑒定：使用M13 Forward Primer，M13 Reverse Primer引物測序並分析。
注意事項
1. 在使用該產品時宜將產品存放在冰盒內或冰浴上，使用完畢後該立即放置於-20℃保存。
2. 大腸桿菌菌株DB3.1、ccdB Survival、Stable、JM109、XL1-Blue和XL10-Gold，這些菌株可以耐受CcdB，可以用於繁殖或保存含ccdB的質粒，因此不適用pSWE-Topo Zero Vector進行篩選。其他實驗室常用的DH5α、Top10、TG1等不耐受Ccdb的大腸桿菌感受態細胞均適用。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
載體全序列：
GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCCCTTNNNNNNNAAGGGCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAACAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCGGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAACATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT
