Servicebio 2×In-Fusion Cloning Mix Plus
商品編號：G3351-20T
Servicebio 2×In-Fusion Cloning Mix Plus是Servicebio 2×In-Fusion Cloning Mix（G3350）升級產品。2×In-Fusion Cloning Mix Plus可以兼容單個或2~5個多片段定向重組至載體中。使用合適方式將載體線性化，在插入到線性化載體中的目標DNA片段正/反向擴增引物5'端引入線性化載體的末端序列，使得PCR擴增產物的5'和3'末端分別帶有與線性化載體末端一致的序列(15-25 bp)。在2×In-Fusion Cloning Mix Plus預混液中，按一定比例混合這種兩端帶有與線性化載體末端一致序列的PCR產物和線性化載體，50℃反應15-30 min，即可進行轉化感受態細胞，完成定向克隆。
升級的2×In-Fusion Cloning Mix Plus，顯著提高克隆的重組效率。對於單片段DNA重組質粒的構建，使用該預混液獲得的陽性克隆子比例高達99%；而對於2~5個多片段DNA重組質粒的構建，使用該預混液獲得的陽性克隆子比例高達90%。而多片段的同時插入，極大的簡化了實驗步驟，提高效率，節約時間。
Primer設計
(1)單片段Primer設計：插入片段擴增Primer 5'端分別引入與線性化載體兩端一致的15-25 bp序列。設計如下圖：
(2) 多片段Primer設計：載體兩端的Primer設計原則與單片段引物設計原則相同。片段之間重置區域引物設計原則如下：Fragment 1的反向引物和Fragment 2的正向引物有15-25 bp的重疊區域，Fragment 1的反向引物包括重疊區域和反向的特異引物區域, Fragment 2的正向引物包括重疊區域和正向的特異引物區域,依此類推(紅色為重疊區域)。為了提高效率，可增加片段之間的重疊區域並保證其Tm值一致。設計如下圖：
實驗步驟:
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Component |
Volume |
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2×In-Fusion Cloning Mix Plus |
5 μL |
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Vector |
X μL |
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DNA segment |
Y μL |
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Nuclease-Free Water |
Add To 10 μL |
1. 對於單片段重組反應，水浴50℃保持15 min；立即置於冰上冷卻。
2. 對於多片段重組反應，水浴50℃保持30 min；立即置於冰上冷卻（3~5個多片段重組時，適當延長重組時間可提高重組效率，但最長不宜超過1 h）
反應產物轉化
1. 從-80℃冰箱取出感受態細胞(如E. coli DH5α、E. coli Top10等)放置冰上解凍；
2. 將反應後的樣品加入到感受態中，手指輕輕撥動管底混勻，冰浴30 min；
3. 然後產物放置於42℃水浴鍋熱激90 s，結束後，迅速置於冰上，冰浴2-5 min；
4. 取900 μL無菌SOC或LB液體培養基加入EP管中，混勻後，將EP管置於搖床上，220 rpm，37℃培養1 h覆蘇細菌（也可置於37℃培養箱靜置培養1 h）；
5. 根據實驗需求，吸取不同體積已轉化感受態細胞加到含有相應抗生素的LB固體培養基上，將細胞均勻塗布開，待液體完全吸收後將平板倒置於37℃培養箱，過夜培養。
陽性鑒定
挑取平板的上生長出來的單克隆菌落進行菌落PCR鑒定、或經培養後提取質粒酶切或PCR鑒定、或將提取的質粒直接測序分析鑒定。
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