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Servicebio 2×In-Fusion Cloning Mix
商品編號：G3350-20T
Servicebio 2×In-Fusion Cloning Mix可以將單個或2~3個多片段快速連接至載體中，尤其適用於單片段連接，2-3片段連接效率會有降低。使用任意方式將載體線性化，在插入到線性化載體中的DNA片段正/反向擴增引物5'端引入線性化載體的末端序列，使得PCR擴增產物的5'和3'末端分別帶有與線性化載體末端一致的序列(15-25 bp)。在2×In-Fusion Cloning Mix預混液中，按一定比例混合這種兩端帶有與線性化載體末端一致序列的PCR產物和線性化載體，然後冰上(或冰水混合物中)孵育5 min，即可進行轉化感受態細胞，完成定向克隆。
本預混液可實現高效快速的DNA無縫克隆，可用於重組質粒或基因點突變重組質粒的構建，該預混液不依賴於連接酶體系，大大降低載體自連背景，同時無需考慮插入片段自身含有的限制性內切酶位點。對於單片段DNA重組質粒的構建，使用該預混液獲得的陽性克隆子比例高達99%。使用本預混液不依賴於恒溫設備，且在數小時內即可完成從DNA樣品制備到重組產物的轉化塗板培養的全部操作，大大節省時間。
反應條件
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Component |
Volume |
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2×In-Fusion Cloning Mix |
5 μL |
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Vector |
X μL |
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DNA Segment |
Y μL |
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Nuclease-Free Water |
Add To 10 μL |
3，轉化標準操作步驟：
a，從-80℃冰箱取出感受態細胞(如E.coli DH5α、E.coli Top10等)放置冰上解凍；
b，將反應後的樣品加入到感受態中，手指輕輕撥動管底混勻，冰浴30 min；
c，然後產物放置於42℃水浴鍋熱激90 s，結束後，迅速置於冰上，冰浴2-5 min；
d，取900 μL無菌的SOC或LB培養基加入EP管中，混勻後，將EP管置於搖床上，220 rpm，37℃培養1 h覆蘇細菌（也可置於37℃培養箱靜置培養1 h）；
e，根據實驗需求，吸取不同體積已轉化感受態細胞加到含有相應抗生素的LB固體培養基上，將細胞均勻塗布開，待液體完全吸收後將平板倒置於37℃培養箱，過夜培養；
4，陽性克隆鑒定：
挑取平板的上生長出來的單克隆菌落進行菌落PCR鑒定、或經培養後提取質粒酶切或PCR鑒定、或將提取的質粒直接測序分析鑒定。
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