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Servicebio T4 DNA Ligase (5 U/μL )
商品編號：G3340
T4 DNA Ligase（T4 DNA連接酶）可催化Sticky Ends 與Blunt Ends 雙鏈DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合。同時該酶也可以修覆雙鏈DNA，RNA，DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切口。
活性定義：一個單位的酶量可以在37°C的環境中20分鐘內催化1 nmol 32P-標記焦磷酸通過置換反應進入ATP（一個單位等於約200粘末端連接單位）。
T4 DNA Ligase Storage buffer：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% (v/v) glycerol。
5×T4 DNA Ligase Buffer：250 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, Enhancer。
反應條件
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Component |
Volume |
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5×T4 DNA Ligase Buffer |
2 μL |
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T4 DNA Ligase |
0.5-1 μL |
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Vector |
X μL |
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DNA segment |
Y μL |
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Nuclease-Free Water |
Add to 10 μL |
ligation 反應條件
Sticky Ends 25℃連接反應5-30分鐘；Blunt Ends 25℃連接反應不超過2小時或4℃反應過夜。
後續步驟
1. 從-80℃冰箱取出感受態細胞(如E.coli DH5α、E.coli Top10等)放置冰上解凍；
2. 將反應後的樣品加入到感受態中，手指輕輕撥動管底混勻，冰浴30 min；
3. 然後產物放置於42℃水浴反應90 s，結束後，迅速置於冰上，冰浴2-5 min；
4. 取900 μL無菌的SOC或LB培養基加入EP管中，混勻後，將EP管置於搖床上，220 rpm，37℃培養1 h覆蘇細菌（也可置於37℃培養箱靜置培養1 h）；
5. 根據實驗需求，吸取不同體積已轉化感受態細胞加到含有相應抗生素的LB固體培養基上，將細胞均勻塗布開，待液體完全吸收後將平板倒置於37℃培養箱，過夜培養。
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