Servicebio 2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix是採用水解探針法進行qPCR反應的2×預混液。通過抗體法封閉Taq DNA Polymerase的活性，有效抑制引物二聚體的形成，提高擴增特異性與擴增效率，再搭配針對Probe qPCR優化的反應Buffer，可以在寬廣的定量區域內得到良好的擴增曲線，對靶基因定量準確、重覆性好、可信度高。同時本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及藍色可視化加樣示蹤染料，可適用於所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX濃度。使用時只需要加入模板、引物、探針和Nuclease-free Water即可。
實驗步驟
1. 推薦PCR反應體系
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
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2×Universal Blue Probe qPCR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1× |
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Forward Primer (10 μM)a |
0.4μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)a |
0.4μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Probe (10 μM) a |
0.4μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Template b |
Variable |
Variable |
as required |
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Nuclease-free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
a.通常引物和探針終濃度為0.2 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM範圍內調整引物濃度。
b.模板添加量因模板中靶基因的拷貝數不同而不同，進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。在20 μL反應體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）為模板時，添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
2. PCR反應程序（可根據機型適當調整）:
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A. Two-step method |
B. The three-step method |
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stage |
step |
Cycle number |
temperature |
time |
stage |
step |
Cycle number |
temperature |
time |
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Stage 1 |
Predegeneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 1 |
Predegeneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
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Stage 2 |
Denaturation |
40 |
95℃ |
15 sec |
Stage 2 |
Denaturation |
40 |
95℃ |
15 sec |
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Annealing /extension |
60℃ |
30 sec |
Annealing |
55-65℃ |
10 sec |
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Extension |
72℃ |
30 sec |
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a.需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
註意事項
1. 使用前請上下輕輕顛倒混勻，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生氣泡，試劑混勻後再使用。
2. 配制反應液時，試劑請於冰上放置。
3. 本制品中含有熒光染料，配制PCR反應液時應避免強光照射。
4. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性吸頭、盡量避免樣品間的汙染。
5. 避免反覆凍融，解凍後盡量在一個月內使用完畢。
適配機型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
Taqman引物設計原則
1. 先確定探針，再設計引物；
2. 在設計引物時，盡可能靠近探針，而不重疊探針；
3. 避免使用4個或4個以上連續的G；
4. 每個引物的Tm值應為58-60°C；
5. 引物末端最後5個核苷酸不能有超過2個G和C；
6. 引物最好不要含有自身互補序列，否則會形成發夾二級結構；
7. 為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨外顯子；
1. 擴增產物長度應為50-150bp，以獲得最佳的PCR效率；
2. NCBI上的比對結果無其他非特異性產物出現。
Taqman探針設計原則
1. 探針長度應為13-25bp(如果使用常規TaqMan探針，則為13-30bp)；
2. Tm值應為65°C~70°C，通常比引物Tm值高5~10℃，以確保在退火過程中探針優先與目的基因結合；
3. 對於一個引物，鳥嘌呤-胞嘧啶(G+C)的含量應在40%~70%之間；
4. 探針的5'端應避免使用G，因為5'端G會有淬滅作用，即使被切割下來，還會有淬滅作用。
5. 整條探針中，C的含量要明顯高於G的含量，G的含量高會有淬滅作用，這時可以選擇配對的另一條鏈作為探針。
Taqman MGB探針設計原則
1. 一種報告染料(例如，FAM™染料)連接到探針的5‘端；
2. 在探針的3‘端有一個非熒光猝滅基團(NFQ)；
3. MGB的部分附著在NFQ上，MGBs在不增加探針長度的情況下提高了退火溫度(Tm)，所以可以設計更短的探針，但是不能少於13 bp；
4. 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB就可以檢測到(MGB探針將不會與目的基因結合，不產生熒光信號)
