SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Remover)包括專門為第一鏈cDNA合成研發的5×即用型預混液(5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR)和gDNA Remover試劑，可在逆轉反應進行的同時去除模板的基因組殘留，另外配有5×SweScript All-in-One No-RT Control SuperMix，作為無逆轉錄酶的對照，判斷qPCR模板是否來自cDNA。預混液包含有逆轉錄反應所需的所有試劑(SweScript RT, RNase Inhibitor, Random Primer, Oligo(dT)18 Primer, dNTPs以及優化的緩沖體系)。SweScript RT是通過體外進化篩選獲得的突變體逆轉錄酶，具有熱穩定性高，持續合成能力強的特點。gDNA Remover中包含一種熱敏感型DNase，比活是DNase I的30倍，且只作用於dsDNA，高溫條件下易失活。
內容物
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Component Number |
Component |
G3333-50 |
G3333-100 |
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G3337-1 |
5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR |
200 μl |
400 μL |
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G3337-2 |
gDNA Remover |
50 μL |
100 μL |
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G3337-3 |
Nuclease-Free Water |
1 mL |
1 mL |
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G3337-4 |
5×SweScript All-in-One No-RT Control SuperMix for qPCR |
20 μL |
40 μL |
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Manual |
One copy |
One copy |
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實驗步驟
1. 第一鏈cDNA合成與gDNA去除
(1) 反應體系配制（推薦20 μL反應體系）:
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Component |
Volume |
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5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR |
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gDNA Remover |
1 μL |
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Total RNA/mRNA |
0.1 ng-5ug / 10 pg-0.5ug |
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Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
(2) 輕輕混勻並離心；
(3) 逆轉錄程序設置：
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Temperature |
Time |
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25℃ |
5 min |
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42℃ |
15-30 min |
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85℃ |
5 s |
注意事項
1. 操作時請佩戴一次性手套，避免RNase汙染。
2. 務必將5×SweScript All-in-One SuperMix、5×SweScript All-in-One No-RT Control SuperMix、gDNA Remover置於冰上。
3. 5×SweScript SuperMix、5×SweScript All-in-One No-RT Control SuperMix、gDNA Remover等含有高濃度甘油，使用前應短暫離心。
4. 針對高GC或覆雜模板，可預先混合RNA模板、無核酸酶水並在65℃保溫5 min後，迅速置冰上冷卻。然後再加入其他反應組分。
5. 如需做陰性對照，只需將反應體系中的G3337-1 5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR等體積替換成G3337-4 5×SweScript All-in-One No-RT Control SuperMix for qPCR即可。
6. 逆轉錄產物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝後，於-80℃保存，避免反覆凍融。
7. 如後續qPCR引物跨外顯子設計，基因組去除步驟可省略。
