Servicebio SweScript RT II First Strand cDNA Synthesis Kit 利用改造後的突變體逆轉錄酶以總RNA或mRNA為模板，高效逆轉錄合成第一鏈cDNA，試劑盒中包含合成高質量第一鏈cDNA所需的全部試劑，並提供兩種cDNA合成引物供選擇：Random Hexamer Primer和Oligo (dT)18 Primer，合成的單鏈cDNA產物可直接用來進行後續PCR或qPCR反應。SweScript RT II (Reverse Transcriptase)是基於M-MLV Reverse Transcriptase並通過體外進化篩選獲得的突變體逆轉錄酶，SweScript RT II無RNase H活性，避免了第一鏈cDNA合成反應中DNA/RNA雜交體模板中RNA被降解，從而保證第一鏈cDNA合成量和長度；與野生型酶及第一代SweScript RT I相比，第二代SweScript RT II的熱穩定性和cDNA合成效率進一步提高，可在42-65℃範圍內高效合成cDNA，並且最快5 min可完成逆轉錄反應，特別適用於覆雜結構的RNA逆轉錄。
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Component Number |
Component |
G3332-50 |
G3332-100 |
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G3332-1 |
SweScrip RT II Enzyme Mixa |
50μL |
100μL |
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G3332-2 |
5×Reaction Bufferb |
200μL |
400μL |
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G3332-3 |
Oligo (dT)18 Primer (100μM) |
50μL |
100μL |
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G3332-4 |
Random Hexamer Primer (100μM) |
50μL |
100μL |
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G3332-5 |
Nuclease-Free Water |
1 mL |
1 mL |
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Product Manual |
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a：含有RNase Inhibitor；
b：含有dNTP Mixture和Mg2+。
實驗步驟:
第一鏈cDNA合成步驟
1. 逆轉錄反應體系配制（推薦20 μL反應體系）
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Component |
Volume |
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5×Reaction Buffer |
4 μL |
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Oligo (dT)18 Primer (100 μM) |
1 μL |
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or Random Hexamer Primer (100 μM) |
or 1 μL |
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or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
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SweScrip RT II Enzyme Mix |
1 μL |
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Total RNA/mRNA |
0.1 ng-5 μg / 10 pg-0.5 μg |
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Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
注意：針對高GC或覆雜模板，可預先混合RNA模板、逆轉錄引物、無核酸酶水並在65℃保溫5 min後，迅速置冰上冷卻。然後再加入其他反應組分。
2. 輕輕混勻並離心；
3. RT 步驟設定：
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Temperature |
Time |
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25℃a |
5 min |
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55℃b |
5-15 min |
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85℃ |
5 s |
a：如選擇使用Random Hexamer Primer，25℃孵育5 min後，再進行後續反應；如選擇使用Oligo (dT)18 Primer或Gene Specific Primer，可直接進行55℃反應；
b:對於高GC或覆雜模板，可將逆轉錄溫度提高至65℃。
注意事項
1. 操作時請佩戴一次性手套，避免RNase汙染。
2. 逆轉錄產物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝後，於-80℃保存，避免反覆凍融。
3. 如模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)18 Primer，與真核生物mRNA的3' Poly A尾配對，可獲得最高產量的全長cDNA。
4. 原核生物RNA逆轉錄請選用Random Hexamer Primer或Gene Specific Primer。
5. Random Hexamer Primer適用性較廣，適用於mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
6. 如逆轉錄後續為qPCR實驗，可將Oligo (dT)18 Primer與Random Hexamer Primer混合使用，可使mRNA的各個區域cDNA合成效率相同，有助於提高定量結果的真實性和重覆性。
