Servicebio Universal One-Step RT-qPCR Kit是使用嵌合熒光法對靶標RNA序列直接進行實時定量分析的試劑盒。在同一管中，RNA首先逆轉錄為cDNA，然後再進行qPCR反應，避免由於多次開蓋造成樣品間交叉汙染的風險。經過改造的逆轉錄酶熱穩定性顯著提高，可對較覆雜的模板進行有效逆轉，逆轉錄預混液中還包含有RNA抑制劑，能夠有效防止各種來源的RNA的降解。本產品提供的一步法RT-qPCR預混液為2×，其中除了包含熱啟動Taq DNA聚合酶，dNTP、Mg2+、以及其他緩沖成分外，還具有獨特的ROX Passive Reference Dye，可兼容多種qPCR儀器。預混液中還包含有觀察反應體系是否建立的可視化示蹤藍色染料，該藍色染料的光譜與qPCR熒光染料不重疊，不影響反應結果。
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Component Number |
Component |
G3345-100 |
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G3345-1 |
RT Enzyme Mix |
100 μL |
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G3345-2 |
2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix |
1 mL |
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G3345-3 |
Nuclease-Free Water |
1 mL |
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Manual |
One copy |
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實驗步驟
1. 反應總體積20 μL為例
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Component |
Volume |
Final Concentration |
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2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix |
10 μL |
1× |
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RT Enzyme Mix |
1 μL |
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Forward primer（10 µM）a |
0.8 μL |
0.4 μM |
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Reverse primer（10 µM）a |
0.8 μL |
0.4 μM |
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Template RNAb |
Variable |
<1 μg（Total RNA） |
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Nuclease-Free water |
To 20 μL |
a.引物終濃度使用範圍0.2-1.0 μM，推薦引物濃度為0.4 μM。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數不同而不同，進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。推薦模板用量為0.1 ng-100 ng。
2. 推薦的PCR反應程序（可根據機型適當調整）：
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A. Two-step method |
B. Three-step method |
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Stage |
Step |
Cycle |
Temp |
Time |
Stage |
Step |
Cycle |
Temp |
Time |
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Stage 1 |
Reverse transcription |
1 |
55°C |
10 min |
Stage 1 |
Reverse transcription |
1 |
55°C |
10 min |
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Stage 2 |
Pre- denaturation |
1 |
95°C |
1 min |
Stage 2 |
Pre- denaturation |
1 |
95°C |
1 min |
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Stage 3 |
Denaturation |
40 |
95°C |
15 sec |
Stage 3 |
Denaturation |
40 |
95°C |
15 sec |
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Annealing /Extension |
60°C |
1 mina |
Annealing |
55-65°C |
20 sec |
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Extension |
72°C |
30 seca |
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Stage 4 |
Melting curve |
1 |
Instrument default setting |
Stage 4 |
Melting curve |
1 |
Instrument default setting |
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a.若需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；若需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
注意事項
1. 2×Universal Blue One-Step RT-qPCR Mix使用前請上下輕輕顛倒混勻，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生氣泡。
2. 配制反應液時，試劑請於冰上放置。
3. 本制品中含有熒光染料，配制PCR反應液時應避免強光照射。
4. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性槍頭，盡量避免樣品間的交叉汙染。
5. 為了保證反應成功，請使用高質量的RNA模板。反覆凍融的RNA模板會影響擴增，如需多次實驗，可分裝後進行凍存，減少凍融次數。
可符合機型:
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice 系列;
Analytikjena: qTOWER 系列;
LineGene 系列。
