鐵是生物體內重要的金屬元素之一，參與造血、氧氣運輸、增強免疫、某些酶合成與反應活性等多種生理活動。隨著近些年鐵死亡概念的提出，鐵離子含量變化作為鐵死亡的特性之一，也表明鐵離子代謝過程與生物體的健康與疾病有著重要的關系。
Servicebio Total Iron Ion Assay Kit為總鐵離子檢測試劑盒（Total Iron Assay Kit），檢測原理為樣品在特殊條件下，鐵離子被充分釋放，並迅速被試劑中還原劑還原成亞鐵離子。隨後亞鐵離子和檢測探針結合，生成有色物質，並在一定濃度範圍內，生成物質的顏色深淺和鐵離子濃度成正比。
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Component Number |
Component |
G4301-48T |
G4301-96T |
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G4301-1 |
Iron ion standard (1 mmol/L) |
0.5 mL |
0.5 mL |
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G4301-2 |
Total Iron Detection Buffer |
20 mL |
40 mL |
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G4301-3 |
Total Iron Detection Probe |
5 mL |
10 mL |
實驗步驟
1. 樣品準備：
1.1. 血漿、血清樣品：用試劑盒中的總鐵檢測緩沖液以樣品和緩沖液1比4比例充分混合(如有沈澱10000g離心後取上清檢測),用於後續總鐵離子檢測；
1.2. 組織樣品：請使用總鐵檢測緩沖液進行勻漿裂解，其中組織和勻漿液的比例為1比9即可（例如：30 mg比270 μL）；勻漿裂解後，4℃，10000 g離心10-15 min，取上清用於後續總鐵離子的檢測；
1.3. 細胞樣品：細胞收集後，使用總鐵檢測緩沖液重懸細胞，大約每1 X 106個細胞加300 μL勻漿液；勻漿裂解後，4℃，10000 g離心10-15 min，取上清用於後續總鐵離子檢測；
1.4. 鐵離子標準品：使用總鐵檢測緩沖液將鐵離子標準品（1 mmol/L）梯度稀釋，例如取其50 μL加入到950μL超純水中，稀釋為50 μmol/L，並進一步梯度稀釋做標準曲線，即50/25/12.5/6.25/3.125 μmol/L，與待測樣品進行後續檢測後，用於標準曲線法數據分析；或適當地稀釋成一個已知濃度的標準品，與待測樣品進行後續檢測後，用於標準品換算法數據分析；
2. 總鐵離子檢測：
註意：血漿、血清樣品與組織、細胞樣品的檢測體系和操作步驟有一定差異，因此作為參考的標準品需要在相應的體系以及步驟下進行檢測，才能夠進行對應的分析。
2.1. 血漿、血清樣品檢測——操作方式如下表所示；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Total Iron Ion Standard |
50 μL |
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Total Iron Detection Buffer |
50 μL |
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Samples to be tested |
50 μL |
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Total Iron Detection Buffer |
50 μL |
50 μL |
50 μL |
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Mix well and incubate at 37℃ for 15 min |
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Detection Probes |
100 μL |
100 μL |
100 μL |
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Incubate at 37°C for 40 min and detect the absorbance at 593 nm using an enzyme meter. |
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2.2. 組織、細胞樣品檢測——操作方式如下表:
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Total Iron Ion Standard |
100 μL |
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Total Iron Detection Buffer |
100 μL |
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Samples to be tested |
100 μL |
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Total Iron Detection Buffer |
100 μL |
100 μL |
100 μL |
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Mix well and incubate at 37℃ for 15 min |
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Detection Probes |
100 μL |
100 μL |
100 μL |
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Incubate at 37℃ for 40 min, centrifuge at 10000 g for 5 min, take 200 μL of supernatant in an enzyme plate, and detect the absorbance at 593 nm by enzyme marker. |
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3. 數據分析：
註意：總鐵檢測緩沖液為特殊緩沖液，用其勻漿可使檢測數據更加準確，但是會幹擾BCA檢測，如需蛋白濃度計算，請用同批樣品另測濃度。
3.1. 標準曲線法：
3.1.1. 根據梯度稀釋的標準組值-空白組值數據繪制標準曲線：Y=a X+ b(Y為標準組值-空白組值；X為鐵離子標準品濃度；a為標準曲線斜率；b為標準曲線截距)；
3.1.2. 血清血漿樣品總鐵離子濃度計算：
image.png
3.1.3. 組織樣品總鐵離子濃度計算：
image.png
3.1.4. 細胞總鐵離子濃度計算
image.png
3.2. 標準品換算法：
3.2.1. 單位血清血漿樣品總鐵離子濃度計算：
單位樣品總鐵離子濃度（μmol/L）=（樣品組值-空白組值）/（標準組值-空白組值）×標準品總鐵離子濃度（μmol/L）×樣品稀釋倍數
3.2.2. 組織、細胞樣品總鐵離子濃度計算：
組織樣品總鐵離子濃度（μmol/kg鮮重）=（樣品組值-空白組值）/（標準組值-空白組值）×標準品總鐵離子濃度（μmol/L）×樣品稀釋倍數×樣品體積（L）/樣品質量（kg）
3.2.3. 細胞樣品總鐵離子濃度計算：
細胞樣品總鐵離子濃度（μmol/10^6）=（樣品組值-空白組值）/（標準組值-空白組值）×標準品總鐵離子濃度（μmol/L）×樣品稀釋倍數×樣品體積（L）/細胞量（10^6個）
注意事項
1. 使用前輕輕晃動各類試劑，確保各成分均勻條件下使用。
2. 標準品換算法分析數據時，需待測樣品和標準品濃度處於試劑盒線性檢測量程內；標準曲線法分析數據時，確保標準曲線R2＞0.99。
3. 避免使用鐵制物品處理或轉移樣品。
4. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。
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Testing Indicators |
Total Iron Ion Concentration |
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Sample type |
Serum (plasma), tissue, cells |
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Detection sensitivity and range |
0.762 μmol/L；0.762-50 μmol/L |
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Recovery rate |
>99% |
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Intra-batch CV |
<5% |
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Inter-batch CV |
<5% |
