自由基是人體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物，能夠攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化。在脂質過氧化過程中會形成脂質過氧化物，其中丙二醛（MDA）是生物體過氧化產物中常見的一類。因此MDA水平常被用作評判樣品中脂質過氧化水平，應用於氧化應激、鐵死亡等研究領域。
Servicebio Malondialdehyde (MDA) Assay Kit (for Tissue and Blood) 利用MDA在高溫環境下可與硫代巴比妥酸（TBA）反應形成一種棕紅色覆合物，並可以通過吸光度或熒光強度檢測的原理，經過本司研發團隊的優化和調試，更適用於組織、血清/血漿樣本的MDA定量檢測。且本試劑盒中提供抗氧化劑，可以避免樣品在檢測的過程中發生額外氧化，使檢測結果更加準確。
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Component Number |
Component |
G4302-48T |
G4302-96T |
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G4302-1 |
MDA standard (200 μM) |
1 mL |
1 mL |
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G4302-2 |
MDA Detection Probes |
1 (dry powder) |
2 (dry powder) |
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G4302-3 |
MDA Assay Buffer |
30 mL |
60 mL |
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G4302-4 |
Antioxidant reagents |
200 μL |
2×200 μL |
實驗步驟
1. 樣品準備：
1.1. 血漿、血清樣品：可直接用於MDA檢測；
1.2. 組織樣品：使用合適的緩沖液（PBS、生理鹽水等）或IP裂解液（推薦G2038）進行勻漿裂解，其中組織和試劑的比例為1比9即可(g:mL)；勻漿裂解後，4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續MDA檢測；
2. 檢測準備工作：
2.1. MDA探針工作液配制：在MDA檢測探針瓶中加入5 mL超純水，在煮沸條件充分溶解；趁熱加入5 mL冰醋酸（自備）混勻，配制成MDA探針工作液（4℃可保存一個月）；
2.2. MDA檢測工作液配制：根據所測樣品數（含標準品），參考下表合理配制；
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Component |
1 sample |
10 samples |
50 samples |
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MDA Assay Buffer |
600 μL |
6000 μL |
30 mL |
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MDA Probe Working Solution |
200 μL |
2000 μL |
10 mL |
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Antioxidant reagents |
4 μL |
40 μL |
200 μL |
2.3. MDA標準品配制：根據需要，使用PBS或超純水將MDA標準品（200 μM）梯度稀釋（例如吸光度法可設置50/25/12.5/6.25/3.125 μmol/L；熒光強度法可設置10/8/6/4/2 μmol/L），與待測樣品進行後續檢測後，用於標準曲線法數據分析；或適當地稀釋成一個已知濃度的標準品（如50 μmol/L），與待測樣品進行後續檢測後，用於標準品換算法數據分析；
3. MDA檢測：
3.1. 根據下表將樣品和MDA檢測工作液充分混合；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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MDA standard |
20 μL |
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PBS or water |
20 μL |
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Samples to be tested |
20 μL |
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MDA assay working solution |
800 μL |
800 μL |
800 μL |
3.2. 在95℃條件下，孵育40 min；
3.3. 孵育結束後，立即冰浴5 min；
3.4. 冰浴結束後，10000 g 離心10 min，取200 μL上清於透明96孔板中，使用酶標儀檢測532 nm處吸光度；或取200 μL於黑色96孔板中，使用酶標儀檢測熒光強度（Ex 525/Em 553）；建議優先吸光度法進行檢測，當樣品濃度過低，例如：1 μmol/L以下，可使用熒光強度法進行檢測。
4. 數據分析：
數據分析前，需計算待測組織樣品蛋白濃度。可通過BCA蛋白定量檢測試劑盒（G2026）對待測樣品進行蛋白濃度檢測。
4.1. 標準曲線法：
4.1.1. 根據梯度稀釋的標準組值-空白組值數據繪制標準曲線：Y=a X+ b(Y為標準組值-空白組值；X為MDA標準品濃度；a為標準曲線斜率；b為標準曲線截距)；
4.1.2. 血清/血漿樣品MDA濃度計算：
單位樣品MDA（μmoL/L）=[（樣品組值-空白組值）-b]/a×樣品稀釋倍數
4.1.3. 組織樣品MDA濃度計算：
單位樣品MDA（μmol/gprot）=[（樣品組值-空白組值）-b]/a×樣品稀釋倍數/樣品蛋白濃度（gprot/L）
4.2. 標準品換算法：
4.2.1. 血清血漿樣品MDA濃度計算：
單位樣品MDA（μmol/L）=（樣品組值-空白組值）/（標準組值-空白組值）×MDA標準品濃度（μmol/L）×樣品稀釋倍數
4.2.2. 組織樣品MDA濃度計算：
單位樣品MDA（μmol/gprot）=（樣品組值-空白組值）/（標準組值-空白組值）×MDA標準品濃度（μmol/L）×樣品稀釋倍數/組織蛋白濃度（gprot/L）
註意事項
1. 使用前輕輕晃動各類試劑，確保各成分均勻條件下使用。
2. 水浴加熱時，註意避免液體暴沸濺出。
3. 本試劑盒可用吸光度法和熒光強度法進行MDA檢測，當樣品濃度過低，建議使用熒光強度法進行檢測；如果設備不允許的情況下，可通過提高樣品在樣品和MDA檢測工作液混合液中占比；也可以適當延長95℃孵育時間。
4. 標準品換算法分析數據時，需待測樣品和標準品濃度處於試劑盒線性檢測量程內；標準曲線法分析數據時，確保標準曲線R2＞0.99。
5. 當待測樣品處於溶血或其他特殊狀態情況下，建議適當添加一組樣品組，不進行95℃孵育處理，作為對照組，樣品數據分析時，樣品組值-對照組值（不用減去空白組值）。
6. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。
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Testing Indicators |
MDA concentration |
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Sample type |
tissue, blood |
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Detection Sensitivity and Range(Absorbance method) |
0.548 μmol/L; 0.548-100 μmol/L |
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Detection Sensitivity and Range(Fluorescence method) |
0.036 μmol/L; 0.036-10 μmol/L |
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Recovery rate |
100±5% |
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Intra-batch CV |
＜5% |
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Inter-batch CV |
＜5% |
