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Servicebio Total Glutathione (T-GSH) Assay Kit
商品編號：G4303-48T
谷胱甘肽（谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）是一種由3個氨基酸殘基組成的小肽，廣泛存在於機體中。谷胱甘肽以還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）兩種不同的形式存在，並且可以在一定條件下互相轉換。GSH是動物細胞中重要的抗氧化劑，且是絕大多數細胞巰基的主要來源。在生理條件下，由於GSSG會被谷胱甘肽還原酶酶促還原，因此，GSH是機體內主要存在形式。
Servicebio Total Glutathione (T-GSH) Assay Kit利用谷胱甘肽還原酶將GSSG還原成GSH，再通過GSH與DTNB反應，生成TNB和GSSG的原理。其中產生的TNB與總谷胱甘肽呈現正相關性，因此，可通過測定TNB產生量來評估總谷胱甘肽（T-GSH）的量。GSSG在谷胱甘肽還原酶的作用下再次轉換生成GSH，然後繼續和DTNB反應的循環體系作用下，也大大加強了檢測靈敏性。
操作步驟
1. 前處理和準備工作：
1.1. 樣品前處理
1.1.1. 血漿、血清樣品：1：4的比例加入蛋白去除試劑，充分混勻；4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續總谷胱甘肽檢測；
1.1.2. 組織樣品：添加蛋白去除試劑到組織中進行勻漿裂解（重量mg：體積μL為1：9，例如：20 mg比180 μL）；勻漿裂解後，4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續總谷胱甘肽檢測；
1.1.3. 細胞樣品：細胞收集後，使用蛋白去除試劑重懸細胞，大約每1 X 10^7個細胞加100-200 μL 試劑，對其進行超聲或冰上裂解 10-20 min；處理後，4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續總谷胱甘肽檢測；
1.2. 標準品配置和準備：
1.2.1. 谷胱甘肽標準品（GSH粉末）在低速離心機上離心，確保粉末都在管底；使用500 μL無菌超純水溶解，配制成谷胱甘肽標準品（GSH，1mmol/L），建議分裝後-20℃保存，1個月內用完；
1.2.2. 蛋白去除試劑和超純水1：9的比例進行混合，並用其對谷胱甘肽標準品（1 mmol/L）進行梯度稀釋（例如取其50 μL標準品加入上述950 μL混合液中，稀釋為50 μmol/L，並進一步梯度稀釋做標準曲線，即50/25/12.5/6.25/3.125 μmol/L），與待測樣品進行後續檢測後，用於標準曲線法數據分析。
2. 總谷胱甘肽檢測：
2.1. 將谷胱甘肽還原酶和總谷胱甘肽檢測緩沖液1：9混合，配置成谷胱甘肽檢測工作液；
2.2. 將檢測探針和超純水1：19混合配置成檢測探針工作液；
2.3. 參考下表進行總谷胱甘肽檢測；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Glutathione standard |
20 μL |
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PBS or water |
20 μL |
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Samples to be tested |
20 μL |
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Glutathione assay working solution |
160 μL |
160 μL |
160 μL |
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Mix well and incubate for 5min |
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Detection Probe Working Solution |
20 μL |
20 μL |
20 μL |
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Shock the plate for 1 min, incubate at room temperature (25°C) for 20 min, and detect the absorbance at 412 nm using an enzyme meter. |
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