谷胱甘肽（谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）是一種由3個氨基酸殘基組成的小肽，廣泛存在於機體中。谷胱甘肽以還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）2種不同的形式存在，並且可以在一定條件下互相轉換。GSH是動物細胞中重要的抗氧化劑，且是絕大多數細胞巰基的主要來源。在生理條件下，由於GSSG會被谷胱甘肽還原酶酶促還原，因此，GSH是機體內主要存在形式。
本試劑盒利用谷胱甘肽還原酶將GSSG還原成GSH，再通過GSH與DTNB反應，生成TNB和GSSG。其中產生的TNB與總谷胱甘肽呈現正相關性，因此，可通過測定TNB產生量來評估總谷胱甘肽（T-GSH）的量。同時本試劑盒中提供GSH清除劑，可用其去除樣品中原有GSH，剩余的GSSG在谷胱甘肽還原酶的作用下再次轉換生成GSH，然後和DTNB反應，從而測得GSSG含量。
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Component Number |
Component |
G4304-48T |
G4304-96T |
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G4304-1 |
Protein Removal Reagent |
10 mL |
20 mL |
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G4304-2 |
Glutathione standard (GSSG Powder) |
1 |
2 |
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G4304-3 |
Glutathione Assay Buffer |
7.5 mL |
15 mL |
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G4304-4 |
Glutathione reductase |
0.5 mL |
1 mL |
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G4304-5 |
Detection Probes |
50 μL |
100 μL |
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G4304-6 |
Substrate |
1 mL |
2×1 mL |
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G4304-7 |
GSH scavenger |
300 μL |
600 μL |
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Manual |
1 pc |
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實驗步驟
1. 樣品以及前準備：
1.1. 樣品前處理
1.1.1. 血漿、血清樣品：1比4比例加入蛋白去除試劑，充分混勻；4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續檢測；
1.1.2. 組織樣品：添加蛋白去除試劑到組織中進行勻漿裂解（重量mg：體積μL為1：9，例如：20 mg比180 μL）；勻漿裂解後，4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續檢測；
1.1.3. 細胞樣品：細胞收集後，使用蛋白去除試劑重懸細胞，大約每1 X 107個細胞加100-200 μL 試劑，對其進行超聲或冰上裂解 10-20 min；處理後，4℃，10000 g 離心 10-15 min，取上清用於後續檢測；
1.2. 標準品配置和準備：
1.2.1. 谷胱甘肽標準品（GSSG粉末）在低速離心機上離心，確保粉末都在管底；使用500 μL無菌超純水溶解，配制成谷胱甘肽標準品（GSSG，1mmol/L），建議分裝後-20℃保存，1個月內用完；
1.3. 蛋白去除試劑和超純水按1：9進行混合，並用其對谷胱甘肽標準品（1mmol/L）進行梯度稀釋（例如取其40 μL標準品加入上述960 μL混合液中，稀釋為40 μmol/L，並進一步梯度稀釋做標準曲線，即40/20/10/5/2.5 μmol/L），與待測樣品進行後續檢測後，用於標準曲線法數據分析。
1.4. 將谷胱甘肽檢測緩沖液：谷胱甘肽還原酶：檢測探針=150:10:1，配置成谷胱甘肽檢測工作液；
2. 總谷胱甘肽（T-GSH）檢測：
2.1. 對總谷胱甘肽檢測樣品進行前處理（註意：因為GSSG檢測需要對樣品進行前處理工作，為了確保體系的一致性，此處需對樣品進行同體系前處理後，再進行總谷胱甘肽檢測）；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Glutathione standard |
50 μL |
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PBS or water |
5 μL |
55 μL |
5 μL |
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Samples to be tested |
50 μL |
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Shake well and incubate for 1 h at room temperature. |
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2.2. 參考下表進行總谷胱甘肽檢測（此處待測樣品，為2.1步驟處理過的樣品）；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Glutathione standard |
20 μL |
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PBS or water |
20 μL |
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Samples to be tested |
20 μL |
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Glutathione assay working solution |
160 μL |
160 μL |
160 μL |
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Mix well and incubate for 5 min |
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substrate |
20 μL |
20 μL |
20 μL |
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Shock the plate for 1 min, incubate at room temperature (25°C) for 20 min, and detect the absorbance at 412 nm using an enzyme meter. |
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3. 氧化型谷胱甘肽（GSSG）檢測：
3.1. 參考下表對還原型谷胱甘肽進行清除處理；
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Glutathione standard |
50 μL |
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PBS or water |
50 μL |
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Samples to be tested |
50 μL |
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GSH scavenger |
5 μL |
5 μL |
5 μL |
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Shake well and incubate for 1 h at room temperature. |
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3.2. 參考下表對氧化型谷胱甘肽進行檢測（此處待測樣品，為3.1步驟處理過的樣品）
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standard tube |
blank tube |
sample tube |
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Glutathione standard |
20 μL |
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PBS or water |
20 μL |
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Samples to be tested |
20 μL |
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Glutathione assay working solution |
160 μL |
160 μL |
160 μL |
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Mix well and incubate for 5 min |
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substrate |
20 μL |
20 μL |
20 μL |
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Shock the plate for 1 min, incubate at room temperature (25°C) for 20 min, and detect the absorbance at 412 nm using an enzyme meter. |
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