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Servicebio Cas9 Nuclease(SpCas9)
商品編號：G3425-50PMOL
本產品Cas9 Nuclease(SpCas9)，即CRISPR-associated endonuclease Cas9，是由大腸桿菌重組表達的Streptococcus pyogenes來源的RNA引導的序列特異性雙股DNA內切酶。 Cas9 Nuclease發揮雙股DNA內切酶活性必須依賴gRNA（也稱為sgRNA，single guide RNA）介導。 Cas9 Nuclease含有兩個切割活性位點，分別切割目標DNA的兩條鏈產生目標DNA雙股斷裂，其切割位點位於目標序列內，離PAM（5'-NGG-3'）區3個鹼基的位置。如果標靶DNA雙股斷裂發生在細胞內，由於細胞本身的DNA修復系統會造成基因標靶位點的插入、缺失或替換，導致基因的缺失突變。
用途：體外gRNA篩選、體外gRNA引導特定雙股DNA剪切等。
來源：Streptococcus pyogenes來源核酸內切酶，大腸桿菌重組表現。
純度及濃度： SDS-PAGE檢測純度≥95%，無RNase殘留，無非gRNA依賴的DNase殘留，1 μM。
失活或抑制： 65℃條件下5 min完全失活。
酵素儲存緩衝液： 10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50%(v/v) glycerol，pH 7.4。
Cas9 Reaction Buffer(10х)： 500 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mM MgCl 2 , 1 mg/mL BSA, pH 7.9。
圖1. Cas9 Nuclease酶活性測試效果圖。反應體系：20 μL ddH 2 O、3 μL Cas9 Reaction Buffer(10х)、3 μL 300 nM gRNA(Target sequence：5'-ATATAAATCAGCATCCATGT-3')、1 μL Cas9 Nuclease(分別為4、2、1、0.2 pmol)，25℃預孵育15 min（CT表示體係用1 μL Nuclease-free water取代Cas9 Nuclease），然後加入3 μL 30 nM的pET28a線性化質粒，37℃孵育15 min後終止反應，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。由圖中可看到gRNA與Cas9結合後，引導後者至pET28a與gRNA互補的序列酶切產生4314 bp和1324 bp的片段。
實驗步驟
1. 準備體外消化反應各種試劑（將Cas9 Nuclease、gRNA、底物DNA、Cas9 Reaction Buffer於冰浴上，gRNA稀釋至300 nM，底物DNA稀釋至30 nM）；
2. 配製反應體系（以30 μL體系為例）：
| Reagent | Volume |
| Nuclease-free water | 20 μL |
| Cas9 Reaction Buffer(10х) | 3 μL |
| gRNA(300 nM) | 3 μL |
| Cas9 Nuclease(1 μM) | 1 μL |
| Total Reaction Volume | 27 μL |
3. 渦旋混勻後室溫離心數秒，使液體聚於管底，25℃預孵育10 min；註：反應體系中可加入終濃度1U/μL的RNase Inhibitor，防止RNase污染（對應減少Nuclease-free water體積維持反應總體係不變）。
4. 再向系統中加入3 μL 30 nM的底物DNA（終體積30 μL），輕輕混勻後離心沉澱液體，37℃孵育15 min，反應時間可依實際情況適當延長30-120 min；
5. 反應結束後，每個樣品中加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL，貨號G1234）室溫孵育10 min（或65℃熱處理5-10 min）；
6. 反應體係可以直接以適當濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。如不立即電泳，可將系統置於-20℃備用。
注意事項
1. 本產品使用需注意RNase-free、DNase-free相關操作，所使用試劑耗材都應確保Nuclease-free。
2. 酵素製品使用時應放在冰盒內或冰上，建議分裝使用，使用完畢後應立即置於-20℃保存。
3. 為了您的安全和健康，請穿著實驗服並戴上一次性手套操作。
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