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Servicebio Cas9(D10A) Nickase
商品編號：G3426-50PMOL
本產品Cas9(D10A) Nickase，是野生型Cas9 Nuclease(SpCas9)（含有兩個切割活性中心）的單點突變突變體，透過突變使其喪失一個切割活性中心，從而實現在與sgRNA靶序列互補的DNA單鏈上產生切口，形成功能性的單股斷裂。 Cas9(D10A) Nickase如果配合一對gRNA使用，同樣可以達到Cas9 Nuclease相同的雙股斷裂效果。
用途：體外gRNA引導特定雙股DNA中單股斷裂、或雙股DNA斷裂等。
來源：Streptococcus pyogenes來源，大腸桿菌重組表現。
純度及濃度： SDS-PAGE檢測純度≥95%，無RNase殘留，無非gRNA依賴的DNase殘留，1 μM。
失活或抑制： 65℃條件下5 min完全失活。
酵素儲存緩衝液： 10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50%(v/v) glycerol，pH 7.4。
Cas9 Reaction Buffer(10х)： 500 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mM MgCl 2 , 1 mg/mL BSA, pH 7.9。
圖1. Cas9 Nickase(D10A或H840A)酵素活性效果圖。反應體系：20 μL ddH 2 O、3 μL Cas9 Reaction Buffer (10х)、3 μL 300 nM gRNA (Target sequence：5'-TGCGGTAAAGCTCATCAGCG-3')、1 μL Cas9 Nickase (分別為2、1、0.5、0.25 pmol)，25℃預孵育15 min（CT表示體係用1 μL Nuclease-free water代替Cas9 Nickase）。再加入3 μL 30 nM的pET28a質粒，37℃孵育15 min後以1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。由圖中可看出gRNA與Cas9 Nickase結合後，引導後者至pET28a與gRNA互補處造成單股DNA斷裂。
實驗步驟
1. 準備體外消化反應各種試劑[將Cas9(D10A) Nickase、gRNA、底物DNA、Cas9 Reaction Buffer於冰浴上，gRNA稀釋至300 nM，底物DNA稀釋至30 nM]；
2. 配製反應體系（以30 μL體系為例）：
| Reagent | Volume |
| Nuclease-free water | 20 μL |
| Cas9 Reaction Buffer(10х) | 3 μL |
| gRNA(300 nM) | 3 μL |
| Cas9(D10A) Nickase(1 μM) | 1 μL |
| Total Reaction Volume | 27 μL |
3. 渦旋混勻後室溫離心數秒，使液體聚於管底，25℃預孵育10 min；註：反應體系中可加入終濃度1U/μL的RNase Inhibitor，防止RNase污染（對應減少Nuclease-free water體積維持反應總體係不變）。
4. 再向系統中加入3 μL 30 nM的底物DNA（終體積30 μL），輕輕混勻後離心沉澱液體，37℃孵育15 min，反應時間可依實際情況適當延長30-120 min；
5. 反應結束後，每個樣品中加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL，貨號G1234）室溫孵育10 min（或65℃熱處理5-10 min）；
6. 反應體係可以直接以適當濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。如不立即電泳，可將系統置於-20℃備用。
注意事項
1. 本產品使用需注意RNase-free、DNase-free相關操作，所使用試劑耗材都應確保Nuclease-free。
2. 酵素製品使用時應放在冰盒內或冰上，建議分裝使用，使用完畢後應立即置於-20℃保存。
3. 為了您的安全和健康，請穿著實驗服並戴上一次性手套操作。
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